苯甲醇是一種重要的中間體，能用于化學(xué)、制藥和聚合物工業(yè)中許多不同化合物的商業(yè)制備。目前苯甲醇的工業(yè)生產(chǎn)主要利用甲苯作為原料，通過(guò)化學(xué)法生成，該過(guò)程繁瑣且會(huì)生成大量副產(chǎn)物而污染環(huán)境。因此，如何發(fā)展苯甲醇的綠色高效生產(chǎn)方法一直受到工業(yè)界和學(xué)術(shù)界共同關(guān)注。
近日，湖北大學(xué)生命科學(xué)院、省部共建生物催化與酶工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李愛(ài)濤教授、陳純琪教授和郭瑞庭教授團(tuán)隊(duì)共同合作，成功解決了這一難題。他們首次解析了一種特殊的“萬(wàn)能酶”P450tol及其復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)，并基于此構(gòu)建了一種活性和穩(wěn)定性均明顯提升的人工融合酶，實(shí)現(xiàn)了苯甲醇的高效綠色生物合成，相關(guān)研究成果發(fā)表于國(guó)際期刊《催化作用》。
迄今唯一可天然催化甲苯生成苯甲醇的酶
酶，這種地球生命中最強(qiáng)大的化學(xué)工具，通過(guò)理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化手段，展現(xiàn)出了在生物催化領(lǐng)域的強(qiáng)大功能。其中，細(xì)胞色素P450酶能夠識(shí)別多種底物(參與生化反應(yīng)的物質(zhì))，因此也被稱為“萬(wàn)能酶”。而利用基因工程改造P450酶來(lái)量身定制化學(xué)反應(yīng)過(guò)程和生產(chǎn)工藝，成為一個(gè)熱門研究方向。
李愛(ài)濤從甲苯降解菌中鑒定了一種特殊的P450酶，并將其命名為P450tol。它能以甲苯為底物，生成專一的產(chǎn)物苯甲醇，成為迄今發(fā)現(xiàn)的唯一可以天然催化甲苯生成苯甲醇的酶。
目前苯甲醇通用的工業(yè)生產(chǎn)采取兩步法，以甲苯為原料，需要用到劇毒的氯氣和強(qiáng)堿氫氧化鈉，并產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物。“之所以會(huì)這樣，是因?yàn)閭鹘y(tǒng)化學(xué)合成過(guò)程中，繞不開(kāi)C-H鍵官能團(tuán)化。”李愛(ài)濤解釋，由于C-H鍵具有較高的解離能，通常具有較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性和較低的化學(xué)反應(yīng)性，因此，C-H鍵官能團(tuán)化是傳統(tǒng)化學(xué)合成中一個(gè)極大的難題。
因此，李愛(ài)濤發(fā)現(xiàn)的P450tol讓人們看到了生物合成苯甲醇的希望。然而P450tol三維結(jié)構(gòu)信息的缺乏，限制了P450tol的相關(guān)基礎(chǔ)研究與未來(lái)應(yīng)用。
配體結(jié)合方式使反應(yīng)更精準(zhǔn)高效
要改造高效的P450tol，必須揭開(kāi)酶結(jié)構(gòu)的面紗。由于2020年郭瑞庭團(tuán)隊(duì)首次解析了一種自給自足P450酶的全長(zhǎng)晶體結(jié)構(gòu)，李愛(ài)濤選擇與郭瑞庭團(tuán)隊(duì)合作，順利解析出P450tol的空結(jié)構(gòu)以及與底物甲苯及產(chǎn)物苯甲醇的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)信息表明，P450tol能幫助甲苯通過(guò)一步反應(yīng)生成苯甲醇，且反應(yīng)沒(méi)有副產(chǎn)物。
陳純琪介紹，P450酶的活性區(qū)都會(huì)帶一個(gè)血紅素分子參與催化反應(yīng)，我們解析的P450tol也不例外，底物甲苯位于由一系列疏水的氨基酸組成的口袋中，甲苯的甲基朝向血紅素中心的鐵離子，兩個(gè)氨基酸(F329和A279)分別位于底物的兩側(cè)，牢牢鉗住了甲苯的苯環(huán)，甲苯前方還有一個(gè)氨基酸(V326)負(fù)責(zé)固定整個(gè)甲苯的位置，這樣催化反應(yīng)就可以精確的發(fā)生在芐基位，而不是其他位置，如此精巧地反應(yīng)也只有這種“萬(wàn)能酶”可以做到了。
“此外，我們也觀察到了一個(gè)非常有意思的現(xiàn)象，甲苯或苯甲醇并不能將P450tol的活性區(qū)完全占據(jù)，還有一些多余的空間，所以我們猜測(cè)P450tol或許可以結(jié)合比甲苯或苯甲醇更大一些的底物。”陳純琪表示，復(fù)合體結(jié)果與團(tuán)隊(duì)推測(cè)的一致，P450tol也可以與一些鹵代甲苯形成復(fù)合體，且可以精確地在芐基位發(fā)生羥基化反應(yīng)。所有這些結(jié)果都顯示，配體會(huì)以有利于反應(yīng)發(fā)生的方式結(jié)合并參與反應(yīng)，這也使酶的反應(yīng)更精準(zhǔn)而高效。
人工融合酶有望用于工業(yè)生產(chǎn)
自然界中大部分的P450酶都需要一個(gè)能夠與之匹配的還原酶來(lái)提供電子以發(fā)生催化反應(yīng)，這對(duì)于后續(xù)的應(yīng)用也是一個(gè)難題。為了實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用，尋找天然的自給自足型P450酶或者索性構(gòu)建高效的自給自足型P450人工融合酶成為科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。
“我們將P450tol和CYP116B46的還原酶結(jié)構(gòu)域融合，構(gòu)建出自給自足型人工融合酶，其活性、穩(wěn)定性和半衰期都獲得了很大的提升。”李愛(ài)濤說(shuō)。
不僅如此，P450tol-CYP116B46還可以催化丙基苯在近末端或芐基位區(qū)域選擇和立體選擇羥基化，這些羥基化產(chǎn)物中，有些是非常重要的藥物中間體，如安非他命、司立吉林和組蛋白酶K抑制劑的組成成分。目前，P450tol和CYP116B46的融合是世界上首例報(bào)道的穩(wěn)定性和活性均大幅提升的人工融合酶，未來(lái)有望應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。
基于P450tol的三維結(jié)構(gòu)，郭瑞庭團(tuán)隊(duì)使用蛋白質(zhì)工程的手段理性設(shè)計(jì)和改造，使其反應(yīng)能夠更多地朝向?qū)θ祟愑幸娴姆较虬l(fā)生。
“未來(lái)，隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、人工智能、酶定向進(jìn)化等發(fā)展，通過(guò)理性設(shè)計(jì)和改造，獲得更多新的具有重要功能的酶來(lái)造福于人類，將會(huì)是一個(gè)重要的研發(fā)方向，我們也將繼續(xù)致力于更多P450tol人工融合酶的構(gòu)建。”郭瑞庭說(shuō)。(陳曦)
關(guān)鍵詞： 安非他命 司立吉林 組蛋白酶K抑制劑 羥基化產(chǎn)物 湖北大學(xué)
